Le linézolide pour les nourrissons et les tout-petits atteints de tuberculose disséminée: premiers pas

Contexte Les nourrissons et les tout-petits présentent souvent une tuberculose disséminée et ganglionnaire, Mycobacterium tuberculosis Mtb étant principalement intracellulaire. Le linézolide, utilisé pour traiter la tuberculose chez les adultes, n’a pas été étudié chez les nourrissons. Les nourrissons éliminent les linézolides plus rapidement que les adultes et obtiennent des résultats inférieurs. Pour simuler une maladie intracellulaire, nous avons infecté des THP-macrophages d’origine humaine avec des systèmes Mtb et des systèmes de fibres creuses inoculées. Nous avons réalisé des études de dose-effet et d’ordonnancement des doses dans lesquelles nous avons récapitulé la demi-vie linézolide. des heures rencontrées chez les nourrissons L’échantillonnage répétitif pour la pharmacocinétique du linézolide, la charge intracellulaire de Mtb, la numération monocytaire viable et les lectures de séquençage de l’ARN ont été effectués jusqu’à jours Résultats La demi-vie extracellulaire du linézolide était de ± heures, alors que la demi-vie intracellulaire était de était lié à l’AUC – à la concentration inhibitrice minimale MIC Nous avons identifié un transcrit -gène à l’exposition à des doses toxiques de linézolide. Le plus grand nombre de gènes associés à des protéines ribosomiques, une signature jusqu’ici non associée à la toxicité du linézolide. – le plus grand nombre de gènes différentiellement exprimés sur l’inhibition de l’enzyme mitochondriale Linezolid AUC – mieux expliqué l’inhibition du gène mitochondrial, avec% inhibition à mg × heure / L plus élevé r = Conclusions Nous avons identifié la cible AUC- / MIC linézolide pour une efficacité optimale contre intracellulaire pédiatrique tuberculose, et un SSC- seuil associé à l’inhibition mitochondriale. Ils constituent une fenêtre thérapeutique à cibler pour des doses optimales de linézolide chez les enfants atteints de tuberculose.

La tuberculose disséminée, la pharmacocinétique / pharmacodynamie, la toxicité, le modèle de fibres creuses, le séquençage de l’ARNLa difficulté à traiter les adultes et les enfants atteints de tuberculose multirésistante aux médicaments MDR a suscité un intérêt accru chez les adultes atteints de maladie pulmonaire cavitaire. Cependant, l’efficacité du linézolide chez les enfants atteints de tuberculose multirésistante est toujours au niveau des rapports de cas. Une revue de la littérature compilant des cas d’enfants atteints de tuberculose multirésistante Les doses optimales ne sont pas claires et les doses utilisées ont été copiées à partir des adultes Cependant, le linézolide présente une variabilité pharmacocinétique selon l’âge après l’administration de la dose standard de mg / kg: La clairance systémique est de kg chez les nourrissons, L / heure / kg chez les tout-petits, et L / kg chez les adolescents et les adultes Cela signifie que je Les enfants et les jeunes enfants atteindront une surface relativement basse selon les courbes de concentration en fonction du temps (ASC) par dose en milligrammes par kilogramme mg / kg, car l’ASC est calculée comme la dose quotidienne divisée par la clairance systémique. La maladie atrathoracique demeure la manifestation la plus courante de la tuberculose chez les enfants Cependant, les jeunes enfants, en particulier les nourrissons, ont aussi tendance à développer une tuberculose disséminée Dans la tuberculose disséminée et intrathoracique chez les enfants, le Vtt est principalement intracellulaire. Ce milieu intracellulaire retarde la destruction microbienne de nombreux antibiotiques utilisés pour traiter les mycobactéries, y compris Mtb, malgré une bonne efficacité contre les mêmes mycobactéries extracellulaires Ainsi, lorsqu’il est utilisé pour traiter les enfants atteints de tuberculose, il sera important d’identifier les relations intracellulaires exposition-réponse, ainsi que la clairance intracellulaire des médicaments tels que le linézolide. modèles expérimentaux, ces études devraient également imiter le clearanc rapide De plus, comme l’utilisation prolongée du linézolide est associée à des taux élevés d’effets secondaires hématologiques et neurologiques basés sur l’inhibition des enzymes mitochondriales , il sera important d’identifier les doses qui optimisent la destruction microbienne tout en minimisant la toxicité. , nous avons utilisé le modèle de fibre creuse HFS intracellulaire Mycobacterium tuberculosis Mtb pour identifier les expositions au linézolide qui maximisent la destruction microbienne tout en minimisant la toxicité, sur la base de la pharmacocinétique pédiatrique du linézolide et du séquençage de l’ARN du transcriptome entier ARN-Seq

MATÉRIAUX ET MÉTHODES

Souche bactérienne, lignées cellulaires et conditions de croissance

Avant chaque expérience, le nombre ATCC Mtb HRa de culture stock a été décongelé et cultivé dans un bouillon Middlebrook H complété avec% d’acide oléique-dextrose-catalase OADC à ° C sous% CO et conditions d’agitation Mtb HRa a été choisi sur la base de la capacité à produire une infection stable. sans tuer les macrophages pendant des semaines d’infection expérimentale, contrairement aux souches plus virulentes Des cellules THP humaines ATCC TIB- ont été cultivées dans du milieu RPMI de Roswell Park Memorial Institute complété avec% de sérum fœtal bovin fœtal inactivé par la chaleur à ° C sous% de cellules CO ont été repiqués toutes les heures

Réactifs et fournitures

Les cartouches à fibres creuses ont été achetées auprès de FiberCell Frederick, Maryland Linezolid a été acheté auprès de la pharmacie du Baylor University Medical Center Les bandelettes Etest ont été obtenues auprès de bioMérieux Marcy L’Etoile, France Pour des dosages pour mesurer la concentration en médicament, le linézolide a été acheté à Sigma St Louis, Missouri et Le linézolide-d marqué à l’isotope stable a été acheté auprès des isotopes du CDN Québec, Canada

Conditions de culture et infection intracellulaire

Les cultures de Mtb et de THP ont été préparées comme décrit ci-dessus. Les cellules THP ont été co-incubées avec Mtb à un rapport bactérie-macrophage de: pendant des heures. Les macrophages infectés ont été centrifugés à g pendant quelques minutes pour laver les bactéries extracellulaires. Utilisation d’un hémocytomètre et d’un compteur Coulter Un échantillon de cellules THP a ensuite été rompu pour déterminer le nombre d’unités formant des colonies CFU / mL comme décrit ci-dessous

Détermination de la concentration minimale inhibitrice

La première méthode était la macrodilution en bouillon. La turbidité d’une culture de Mtb en phase exponentielle a été ajustée à une densité bactérienne de × CFU / mL, puis traitée avec des concentrations de linézolide dans le bouillon Middlebrook H de,,,, Les cultures ont été lavées deux fois avec une solution saline normale pour prévenir le transfert de médicament, diluées en série et cultivées sur un milieu gélose Middlebrook H additionné de% d’OADC, appelé « agar ». Les cultures ont été incubées à ° C, et dans des tubes coniques. C et colonies comptées quelques jours plus tard CMI a été définie comme la plus faible concentration qui a empêché au moins% de la croissance observée en l’absence de linézolide La deuxième méthode était un test Epsilomètre Etest Deux cents microlitres de Mtb en croissance exponentielle avec turbidité ajustée à × CFU / mL ont été utilisés pour strier l’agar Les cultures ont été incubées à ° C avec% CO pendant une période de plusieurs heures, après quoi la bande Etest a été appliquée et la cu Laisser incuber pendant un autre jour, à quel point le résultat a été lu. La CMI a été définie comme la concentration à laquelle l’ellipse ou zone d’inhibition croise l’échelle de lecture MIC.

Étude de l’effet de l’exposition des plaques in-well intracellulaires

Les monocytes THP à une densité de x cellules / ml ont été traités avec de la concentration finale de myristate de phorbol -M dans des plaques entières pendant des heures pour les activer puis infectées comme décrit ci-dessus. Mtb a été traité avec des concentrations de linézolide de,,,,,, Les cellules ont été lavées et lysées avec du PBS salin tamponné au phosphate avec% de Tween, diluées en série et cultivées sur agar. Les cultures ont été incubées à ° C et% CO. et les colonies comptées après jours

Études du linézolide sur l’exposition et la dose-ordonnancement dans le système à fibres creuses

La construction de base du HFS était similaire au modèle adulte HFS pour la tuberculose extracellulaire, qui a été récemment qualifié par l’Agence européenne des médicaments et approuvé par la Food and Drug Administration des États-Unis étant donné sa grande précision de prévision. modèle de tuberculose intracellulaire, en changeant le milieu en RPMI / FBS et en inoculant HFS avec des cellules THP infectées, comme décrit récemment en détail Nous avons inoculé des mL de cellules THP infectées par Mtb dans le compartiment périphérique de chaque HFS qui avait été Le linzolide a été administré par des pompes à seringue programmées par ordinateur via un orifice d’infusion dans le compartiment central. Une étude combinée de l’effet de l’exposition et de l’ordonnancement des doses a été réalisée, dans laquelle les HFS étaient administrés. dosé avec du linézolide pour obtenir une exposition à l’ASC de,, ,,,,,, et mg × heure / L, et les systèmes restants ont été dosés avec du linézolide deux fois par jour pour atteindre AUC – expositions qui sont deux fois le programme une fois par jour, mais aux mêmes concentrations de pointe Cela permet de briser la co-linéarité des indices pharmacocinétiques / pharmacodynamiques PK / PD qui se produiraient autrement avec des changements de dose indices PK / PD à l’étude inclus le Rapport AUC / CMI, pic de concentration au rapport CMI pic / CMI et pourcentage de concentration en temps persiste au-dessus de MIC% TMIC La durée du traitement était de jours Des milieux frais ont été pompés dans et hors des HFS à des vitesses prédéfinies pour imiter la demi-linézolide. Les profils de concentrations de linézolide mesurés dans le HFS ont été confirmés en échantillonnant le compartiment central de chaque HFS à des points temporels sur une période de perfusion post-médicamenteuse de 12 heures basée sur une théorie d’échantillonnage optimale Les compartiments périphériques ont été échantillonnés les jours,,,, et pour la quantification de la population Mtb et des cellules THP. Des échantillons ont également été cultivés sur de la gélose additionnée de fois le MIC linézolide pour sous-population résistante aux inezolides à chaque point de temps

Séquençage de l’ARN

Un millilitre de THP-macrophages infectés du HFS a été utilisé pour l’extraction d’ARN en utilisant le kit miRNeasy Qiagen, selon les instructions du fabricant. Les échantillons ont été épuisés d’ARN ribosomal ARN, après quoi ils ont été utilisés pour la préparation de la bibliothèque de séquençage RNA-Seq, puis [Alignement des lectures a été faite en utilisant le logiciel HumanRefSeqBuilt GRChp CLC Genomic workbench ver a été utilisé pour l’alignement et pour les analyses Les données ont été normalisées et des tests statistiques ont été effectués pour trouver les gènes différentiellement exprimés DEG avec valeur P statistiquement significative & lt; après la correction post-test de Bonferroni L’analyse des voies a été réalisée à l’aide du logiciel KEGG de l’Encyclopédie des gènes et des génomes de Kyoto.

Dosage de concentration de linézolide

Nous avons utilisé la chromatographie liquide à dilution d’isotopes stables et l’ionisation par électrospray ESI-spectrométrie de masse en tandem LC-ESI-MS / MS pour déterminer le profil de linézolide concentration-temps Calibrateur, les contrôles et le standard interne linézolid-d ont été inclus dans chaque analyse. le linézolide et le linézolide-d ont été préparés dans: méthanol: eau à une concentration de mg / mL et stockés à – ° CA courbe d’étalonnage du point,,,,,, μg / mL a été préparé en diluant la solution mère de linézolide dans un milieu sans médicament La limite inférieure de la quantification est de μg / mL Des échantillons de contrôle de qualité ont été préparés en ajoutant des étalons pour les niveaux de contrôle μg / mL et μg / mL. Les échantillons ont été préparés dans des plaques -well par addition de μL de calibrateur, contrôle de qualité ou échantillon à μL% d’acide formique dans de l’eau contenant μg / mL de linézolide-d suivi de vortex La séparation chromatographique a été réalisée sur une chromatographie en phase liquide à ultra-haute performance UPLC HSS T -μm × -mm colonne analytique Wa Les composés ont été détectés par MS / MS en utilisant un ESI positif avec un temps de séjour de ms. Les ions observés m / z des valeurs du fragment ont été détectés en ° C à un débit de mL / minute avec un gradient binaire avec un temps d’exécution total de minutes. les ions étaient linézolide m / z → et linézolide-d m / z → L’injection d’échantillon et la séparation ont été effectuées par un UPLC d’Acquity interfacé avec un spectromètre de masse Xevo TQ Waters Toutes les données ont été collectées en utilisant MassLynx version SCN Le pourcentage intra-journalier le coefficient de variation était de% -%

Pharmacocinétique et PK / PD modélisation

Le nombre de THP-macrophages et le volume cellulaire dans chaque échantillon -mL ont été identifiés en utilisant un compteur Coulter automatisé. Le volume cellulaire combiné total a été calculé en multipliant le nombre de cellules dans chaque échantillon par le volume de chaque cellule. et le surnageant enlevé, suivi de la suspension et de la lyse dans le PBS ml. Ensuite, les concentrations intracellulaires et extracellulaires linézolides ont été co-modélisées dans le logiciel ADAPT Premièrement, un modèle de compartiment, de compartiment et de compartiment a été supposé et les paramètres du modèle ont été générés. le modèle a ensuite été choisi en utilisant les critères d’information Akaike, les critères d’information bayésiens et la parcimonie. Les estimations des paramètres pharmacocinétiques dans chaque modèle choisi ont ensuite été utilisées pour calculer l’AUC-, AUC- / MIC,% TMIC et pic / MIC dans chaque liaison HFS. La relation entre la charge bactérienne totale et l’exposition au linézolide a été examinée à l’aide du modèle sigmoïde inhibiteur Emax, dont les paramètres incluent la mortalité maximale Emax en log CFU / mL, la concentration efficace médiatisant% d’Emax EC, la charge bactérienne dans les systèmes non traités Econ, et la pente Hill H

RÉSULTATS

Le MIC linézolide identifié en utilisant à la fois des méthodes de macrodilution en bouillon et de Etest à des occasions distinctes était de mg / L. La destruction microbienne de Mtb intracellulaire par des linézolides dans des plaques bien a révélé la relation inhibitrice sigmoïde Emax montrée dans la figure Comparée à des témoins non médicamenteux. avec des concentrations statiques de linézolide pendant plusieurs jours, on a obtenu un Emax de ± log UFC / mL et une EC de ± mg / L r = La concentration efficace associée à% d’Emax EC, définie comme «optimale», était une concentration en linézolide de mg / L L, qui calcule à une AUC- de mg × heure / L

Figure Vue largeTéléchargement diapositive Concentration vs linézolide dans les plaques A, courbes temps-mort de différentes concentrations de linézolide jours, et B, relation exposition-effet de linézolide et Mycobacterium tuberculosis en utilisant le modèle inhibiteur de la mort microbienne maximale sigmoïde jour Abréviations : UFC, unités formant des colonies; EC, concentration efficace médiatisant% de destruction maximale; Emax, mort maximale; A, courbes temps-mort de différentes concentrations de linézolide les jours,, et B, relation exposition-effet du linézolide et de Mycobacterium tuberculosis en utilisant le modèle inhibiteur de la destruction microbienne maximale sigmoïde le jour Abréviations: UFC, unités formant des colonies; EC, concentration efficace médiatisant% de destruction maximale; Emax, mort maximale; Mtb, Mycobacterium tuberculosisDans le HFS, les concentrations de linézolide étaient mieux décrites par un modèle à compartiments constitué de compartiments extracellulaires et intracellulaires avec différents paramètres pharmacocinétiques. Le modèle vs les concentrations prédites sont montrées sur la figure Le r était, avec une pente de% intervalle de confiance, , ce qui signifie qu’il y avait peu ou pas de biais Les estimations des paramètres pharmacocinétiques extracellulaires du linézolide étaient une clairance totale de ± l – L / heure et un volume de ± L, ce qui se traduisait par une demi – vie de ± heures. , qui se caractérisait par une clairance de ± l – L / heure et un volume de ± L, ce qui se traduisait par une demi – vie de ± heures. Ainsi, la clairance du linézolide des macrophages était environ – inférieure à celle du compartiment extracellulaire, qui représentait pour l’AUC linézolide intracellulaire plus élevée ± par rapport au compartiment extracellulaire

Figure Vue largeTélécharger diapositiveModèle à deux compartiments de concentrations de linézolides prédites vs observées dans le système à fibres creuses La droite de régression et r montrent que le modèle a bien décrit les donnéesFigure View largeTélécharger slideModèle à deux compartiments de concentrations de linézolides prévues et observées dans le système à fibres creuses On a examiné l’indice PK / PD qui a conduit à la destruction microbienne, en utilisant le compartiment extracellulaire équivalant à des expositions «plasmatiques», et constaté que les rapports ASC / CMI avaient le les jours d’échantillonnage, comparés à pic / MIC ou% TMIC A titre d’exemple, le jour pour le AUC- / MIC était, celui pour le pic / MIC, et celui pour% TMIC Dit différemment, le rapport de vraisemblance, calculé en utilisant l’information Akaike critères d’AUC- / MIC étant le principal pilote PK / PD par rapport au pic / MIC était, tandis que par rapport à% TMIC était La relation entre AUC- / MIC et la charge bactérienne sur le jour est montré dans la figure A Le jour, à la fin de l’expérience, le r pour AUC- / MIC était, celui pour pic / MIC, et celui pour% TMIC La relation de AUC- / MIC vs Mtb charge sur le jour est montré Figure B Comme on peut le voir sur la figure, la CE a changé avec le temps, tout comme le r pour les AUC- / MIC et les ratios pic / CMI, cohérents avec d’autres études antituberculeuses dans le passé Cependant, l’Emax n’a pas changé significativement En revanche, en ce qui concerne la sous-population résistante au linézolide, notre analyse n’a pas réussi à faire la distinction entre les sous-populations pharmacorésistantes et les sous-populations pharmacosensibles; ainsi, les paramètres PK / PD associés à la pharmacorésistance acquise n’ont pas pu être déterminés

Figure View largeTélécharger la lameLes courbes d’effet d’exposition des lentilles dans le système à fibres creuses A, la zone de l’heure sous la courbe concentration-temps au rapport de concentration minimale inhibitrice AUC- / MIC vs Mycobacterium tuberculosis Mtb charge unitaire [CFU] le jour est décrit par l’équation montrée, avec une concentration efficace médiant% de la destruction maximale EC qui était une AUC- / MIC de ± B, En jour, la CE avait augmenté -fold, compatible avec les changements et « wobbles » vus dans le traitement de La tuberculose avec d’autres antibiotiques dans le passé Figure Agrandir l’imageTélécharger les courbesLien des courbes d’effet d’exposition dans le système à fibres creuses A, La zone de l’heure sous la courbe concentration-temps au rapport de concentration minimale inhibitrice AUC- / MIC vs Mycobacterium tuberculosis Mtb fardeau Les unités formant des colonies [UFC] le jour sont décrites par l’équation montrée, avec une concentration efficace qui médie le% de destruction maximale EC qui était une AUC- / MIC de ± B, de jour, la CE avait en pli-plié, compatible avec les changements et « wobbles » vus dans le traitement de la tuberculose avec d’autres antibiotiques dans le passé Nous avons effectué RNA-Seq sur les cellules THP infectées sur chaque jour d’échantillonnage; les scores de contrôle de qualité sont présentés dans la figure A La figure montre qu’un séquençage de haute qualité a été réalisé Ensuite, nous avons réaligné les séquences sur le génome humain, ce qui a été réalisé avec succès Figure B Ensuite, comme la dose de mg / kg deux fois par jour est associée avec des taux élevés d’événements indésirables dans le traitement de la tuberculose, nous avons utilisé l’ensemble de données d’ARN humain pour l’exposition au linézolide obtenue par cette dose pour identifier les DEG lors de l’exposition au linézolide comparé aux cultures HFS non linézolide, sur la base d’un Bonferroni ajusté. Nous avons identifié des DEG, qui sont montrés dans un ensemble de données supplémentaires. Les analyses KEGG ont révélé que le plus grand nombre de DEG ont été cartographiés aux ribosomes, alors que les DEG ont été associés à des voies métaboliques associées aux complexes ETC de transport d’électrons mitochondriaux. la signature du transcrit était pour les gènes codant pour les protéines ribosomiques et les ARNr. Le tableau montre que les ARNr humains, codés par les deux mitochondries, étaient régulés à la baisse d Dans des circonstances normales, les protéines ribosomiques sont produites de manière coordonnée avec l’ARNr en quantités équimolaires. Cependant, la surprise majeure dans le tableau est que les gènes pour% du répertoire entier des protéines ribosomales -gène ont été considérablement régulés à la hausse; les autres étaient des pseudogènes

Tableau Gènes différentiellement exprimés codant pour des protéines ribosomiques Changement de pli de gène P de Bonferroni ajusté Valeur Nom de gène FAU protéine ribosomique S RNR – × – ARN, ribosomal RNR – × – ARN, ribosomal RPLA × – protéine ribosomale La RPL protéine ribosomique L RPL protéine ribosomique L RPL Protéine ribosomale L RPL × – Protéine ribosomale L RPLA × – Protéine ribosomale La RPL Protéine ribosomique L RPL × – Protéine ribosomale L RPLP Protéine ribosomale L pseudogène RPL Protéine ribosomique L RPL × – Protéine ribosomique L RPL Protéine ribosomique L RPLP Protéine ribosomale L pseudogène RPL × – Protéine ribosomale L RPL × – Protéine ribosomale L RPL Protéine ribosomique L RPLA Protéine ribosomale La RPL Protéine ribosomique L RPLA × – Protéine ribosomale La RPL × – Protéine ribosomique L RPL – × – Protéine ribosomique L RPL × – Protéine ribosomique L RPL Protéine ribosomique L RPLP × – Protéine ribosomale L RPLP × – Protéine ribosomique, grande, P RPS × – Protéine ribosomale S RPS × – Protéine ribosomique S RPS Protéine ribosomique S RPS × – Protéine ribosomique S RPSA × – Protéine ribosomique SA RPS Protéine ribosomale S RPS Protéine ribosomale S RPS × – Protéine ribosomale S RSLD × – Domaine ribosomique L contenant la modification du facteur génétique Bonferroni-ajusté P Valeur du gène Nom FAU Protéine ribosomique S RNR – × – ARN, ribosomal RNR – × – ARN, ribosomal RPLA × – Ribosomique protéine La RPL Protéine ribosomique L RPL Protéine ribosomique L RPL Protéine ribosomique L RPL × – Protéine ribosomique L RPLA × – Protéine ribosomale La RPL Protéine ribosomique L RPL × – Protéine ribosomique L RPLP Protéine ribosomique L pseudogène RPL Protéine ribosomique L RPL × – Protéine ribosomale L RPL Ribosomique protéine L RPLP Protéine ribosomale L pseudogène RPL × – Protéine ribosomique L RPL × – Protéine ribosomique L RPL Protéine ribosomique L RPLA Protéine ribosomale La RPL Protéine ribosomique L RPLA × – Protéine ribosomale La RPL × – Protéine ribosomique L RPL – × – Protéine ribosomique L RPL × – Protéine ribosomale L RPL Protéine ribosomique L RPL × – Protéine ribosomale L RPLP × – Protéine ribosomale, grande, R RPS × – Protéine ribosomale S RPS × – Protéine ribosomique S RPS Protéine ribosomique S RPS × – Protéine ribosomique S RPSA × – Protéine ribosomale SA RPS Protéine ribosomique S RPS Protéine ribosomale S RPS × – Protéine ribosomale S RSLD × – Ribosomal L contenant le domaine View Large

Tableau Coefficient de détermination de la concentration par rapport à l’ARN lu dans un modèle inhibiteur de la mitose Dysfonctionnement Enzyme Complexe Gène AUC-Cmax Trough Trough Complexe intracellulaire I ND ND NC NC ND NC NC NC NDL NC NC NC NC Complexe III CYTB Complexe IV COX COX COX COXB Complexe CN V ATPB NC ATP Chromosome ALDHA NC Complexe Enzymatique Gène AUC- Cmax Cuvette Trough Complexe Intracellulaire I ND ND NC NC ND NC NC NC NDL NC NC NC NC Complexe III CYTB IV COX COX COX COXB NC Complexe V ATPB NC ATP ATP Chromosome ALDHA NC Boldface indique le plus haut r parmi les mesures de concentrationAbbreviations: AUC-, – à -heure de surface sous la courbe concentration-temps; Cmax, concentration maximale; NC, pas de convergenceView Large

Figure View largeDownload contrôle de la qualité de RNA-Seq et réalignement des lectures A, La distribution des scores PHRED pour chaque base dans les lectures du gène homo sapiens séquencées, générées en utilisant FastQC version L’axe des x montre la position de la base de la fin ‘to’ ; l’axe des ordonnées montre le score de qualité Tous les échantillons présentaient une distribution similaire et présentaient des scores de qualité B, réalignement des lectures par chromosome humain La première colonne montre le rapport entre la longueur de chaque chromosome et la taille du génome. à partir d’un échantillon de système à fibres creuses, étiqueté par exposition au linézolide et jour d’échantillonnage, et montre le rapport du nombre de lectures alignées à un chromosome donné par rapport au nombre total de lectures alignées: En d’autres termes, il est normalisé à la longueur de chromosome Si l’expression du gène était constante à travers le génome, on s’attendrait à ce que le rapport des lectures par chromosome corresponde plus étroitement au rapport de la longueur du chromosome à la taille du génome. Abréviations: AUC-, – à -heure sous la courbe concentration-temps; Chr, chromosomeFigure View largeTélécharger le contrôle de qualité de RNA-Seq et le réalignement des lectures A, La distribution des scores PHRED pour chaque base dans les lectures du gène Homo sapiens séquencées, générées en utilisant FastQC version L’axe des x montre la position de la base du ‘ fin; l’axe des ordonnées montre le score de qualité Tous les échantillons présentaient une distribution similaire et présentaient des scores de qualité B, réalignement des lectures par chromosome humain La première colonne montre le rapport entre la longueur de chaque chromosome et la taille du génome. à partir d’un échantillon de système à fibres creuses, étiqueté par exposition au linézolide et jour d’échantillonnage, et montre le rapport du nombre de lectures alignées à un chromosome donné par rapport au nombre total de lectures alignées: En d’autres termes, il est normalisé à la longueur de chromosome Si l’expression du gène était constante à travers le génome, on s’attendrait à ce que le rapport des lectures par chromosome corresponde plus étroitement au rapport de la longueur du chromosome à la taille du génome. Abréviations: AUC-, – à -heure sous la courbe concentration-temps; Chr, chromosomeLe deuxième plus grand nombre de DEG codés, entre autres, complexes I et complexe IV enzymes de l’ETC, connu pour être inhibé par linézolide chez les patients présentant une toxicité Les gènes sont présentés dans le tableau Ainsi, en utilisant un génome non biaisé Nous avons identifié l’inhibition des gènes codant pour les protéines ETC les plus fréquemment cités pour les cas cliniques de toxicité du linézolide, ce qui est rassurant. En outre, le tableau montre que nous avons également identifié des gènes significativement diminués codant les enzymes complexes III et V. concentration de l’inhibiteur linézolide vs RNA-Seq normalisé lit en utilisant l’équation inhibitrice sigmoïde Emax, avec un tableau montrant que l’inhibition des gènes de l’enzyme mitochondriale était liée à l’AUC-, basé sur le r plus élevé. nous avons utilisé la concentration du modèle inhibiteur médiant% de l’inhibition maximale IC comme seuil cible, comme un pourcentage de réduction de l’activité enzymatique est le plus souvent observé Chez les patients présentant une toxicité symptomatique du linézolide Nous avons constaté que les lectures IC et DEG variaient largement, en fonction du type d’enzyme codée ETC, comme attendu. Nous avons donc sélectionné uniquement les gènes ETC codés par les mitochondries et utilisé les limites de confiance en% le CI pour identifier les seuils suivants d’ASC-mg × heure / L associés à l’inhibition: seuil de ND était, CYTB était, COX était, ATP était, et ATPB était Le plus bas de ceux-ci est l’ASC- de mg × heure / L, qui nous proposons comme l’AUC cible au-dessus de laquelle il y a une augmentation de la toxicité mitochondriale

DISCUSSION

Des études cliniques chez des enfants indiens ont montré que des seuils de concentration d’antibiotiques spécifiques sont associés à l’échec du traitement et à la mort Chez les enfants ; ans, les concentrations seuils basées sur l’échec du traitement étaient l’ASC de l’isoniazide & lt; mg / L × heure et / ou pic de rifampicine & lt; mg / L Cela signifie qu’il existe des concentrations cibles d’antibiotiques spécifiques qui doivent être atteints pour un résultat clinique optimal chez les enfants, et ceux-ci diffèrent de ceux identifiés chez les adultes Ici, nous avons établi le même modèle HFS pour la tuberculose intracellulaire et pédiatrique Profils de concentration-temps de linézolide Nous avons trouvé que l’efficacité de linézolide était liée au rapport ASC-CMI. Ceci est similaire à nos résultats publiés et non publiés de sutezolide et de linézolide dans le modèle murin de tuberculose , mais diffère des résultats de Brown et al. qui a identifié le creux / CMI comme le paramètre PK / PD Fait intéressant, alors que la CE a changé entre jours et, l’Emax n’a pas amélioré Néanmoins, le linézolide encore tué en dessous de la stase Nous avons identifié un rapport AUC- / CMI de la CE, indiquant que c’est l’exposition cible qui doit être atteinte pour une efficacité optimale lorsque le linézolide est dosé pour le traitement de la tuberculose disséminée chez les enfants Chez les adultes, l’exposition PK / PD s associés à la conversion des expectorations et à la rechute, identifiés dans le HFS en utilisant le modèle inhibiteur Emax sigmoïde, étaient dans les% de ceux observés chez les patients des mois à des années après la prévision dans le HFS La précision prédictive du HFS semble également s’étendre à combinaison thérapeutique Il convient de noter que ceci diffère du rapport AUC / CMI que nous avons identifié comme cible pour l’effet stérilisant dans le HFS pour les adultes Ceci est probablement dû à l’accumulation intracellulaire élevée de linézolide Cette concentration intracellulaire élevée Le linézolide permet de réduire la quantité de dose nécessaire pour atteindre l’exposition optimale, même en tenant compte de l’augmentation du métabolisme observée chez les jeunes enfants. En l’absence d’accumulation intracellulaire, une dose beaucoup plus importante serait nécessaire signatures majeures de transcription sur l’exposition au linézolide, probablement pertinentes à la toxicité La première était la régulation à la hausse de l’ARN codant pour des protéines ribosomiques par linézolide, non encore décrit par rapport à un antibiotique, Linezolid tue les bactéries par liaison à la sous-unité ribosomale S bactérienne pour inhiber la traduction à l’initiation de la synthèse des protéines, qui est sélective contre les bactéries En raison d’un certain chevauchement, on s’attendrait à une régulation négative générale des protéines ribosomiques. Ainsi, les extensions remarquables de la régulation à la hausse des lignées jusqu’au linézolide sont surprenantes car les lectures de l’ARN-Seq ont une très forte corrélation avec les découvertes. niveau d’abondance des protéines, par opposition aux réseaux d’expression standard, il est probable que nos résultats seront reflétés au niveau de l’expression des protéines Les manifestations cliniques de cette signature de transcription, le cas échéant, ne sont pas encore claires, mais notre découverte mérite d’être étudiée comment cela pourrait jouer un rôle dans les événements indésirables de linezolid L’analyse RNA-Seq a également identifié une expression réduite de gènes codant pour l’ETC, une cible bien connue de la toxicité mitochondriale Song et al ont lié la toxicité du linézolide aux concentrations minimales chez les patients atteints de tuberculose; Cependant, cette étude n’a pas évalué la corrélation avec AUC- Brown et al a également identifié la dépression comme corrélation avec la toxicité du linézolide dans un modèle HFS Ici, nous avons trouvé que la toxicité du linézolide était plus étroitement liée à l’AUC. Nous proposons que cette concentration seuil soit évitée si la toxicité induite par la concentration en linézolide doit être minimisée. Nous avons réalisé les études actuelles pour informer le dosage du linézolide chez les enfants atteints de tuberculose. Efficacité et toxicité axée sur la concentration La figure est un schéma hypothétique sur la façon dont ces doses pourraient être identifiées. L’objectif de l’identification des doses devrait être de viser la zone de concentration ou la zone au-dessus de la CE mais en dessous de laquelle la toxicité identifier cette zone cible pour la dose optimale de linézolide chez les enfants atteints de tuberculose disséminée, comme indiqué ailleurs dans ce supplément

Une vue ciblant la fenêtre illustrée permettrait d’obtenir une destruction optimale tout en minimisant la toxicité médiée par la dose chez les enfants atteints de tuberculose disséminée. En d’autres termes, les doses utilisées pour traiter la tuberculose disséminée chez les nourrissons et les tout-petits devraient: viser, pas seulement dérivé de ceux des adultes Abréviations: UFC, unités formant des colonies; CE, concentration efficace associée au% de la mortalité maximaleFiguration hypothétique des effets de l’exposition pour l’efficacité et la toxicité Une dose ciblant la fenêtre montrée permettrait une destruction optimale tout en minimisant la toxicité liée à la dose chez les enfants atteints de tuberculose disséminée. pour traiter la tuberculose disséminée chez les nourrissons et les tout-petits, ne pas se limiter à ceux des adultes. Abréviations: UFC, unités formant des colonies; EC, concentration efficace associée à% de destruction maximaleIl y a quelques limites à notre étude Premièrement, nous avons échoué à capturer la sous-population résistante au linézolide en raison des limites du test que nous avons utilisé traumatique. Probablement, cependant, parce que le fardeau bactérien intracellulaire log UFC / mL, qui était inférieur à l’inverse de la fréquence de mutation linezolid La tuberculose chez les enfants est un état paucibacillaire, contrairement à la grande charge bactérienne dans la tuberculose cavitaire Deuxièmement, une seule souche de Mtb a été utilisée tout au long de l’étude. Des études PD seraient préférables Cependant, les macrophages ne survivront probablement pas assez longtemps pour compléter les études de jour, étant donné la virulence des souches cliniques. Néanmoins, à notre connaissance, nos expériences fournissent la première preuve d’expositions cibles optimales pour tuer les populations intracellulaires de MTb prédominantes. chez les enfants atteints de tuberculose disséminée et intrathoracique Nous avons également identifié un seuil de linézol id AUC- au-dessus de laquelle des expositions plus élevées sont susceptibles de conduire à des taux plus élevés d’événements indésirables En outre, nous avons découvert une nouvelle signature transcriptionnelle majeure qui pourrait avoir une pertinence en tant que biomarqueur de la toxicité du linézolide

Remarques

Contributions des auteurs T G et E N ont conçu l’étude; D D, S S et T G ont effectué les études sur les fibres creuses; S J Bush a effectué un travail de bio-informatique D D a écrit le premier brouillon du manuscrit; DD, SS, EN, JGP, SS et TG a écrit le manuscrit Soutien financier Le financement de cette étude a été fourni par l’Institut national des allergies et des maladies infectieuses du National Institutes of Health subvention numéro R AIS parrainage Cet article apparaît dans le cadre du supplément «Un paradigme de développement pour de nouveaux schémas thérapeutiques pour la tuberculose multirésistante et pharmacosensible chez les enfants: FLAME pour le travail et le jeu», parrainé par le Centre de recherche sur les maladies infectieuses et thérapeutique expérimentale CIDRET, Baylor Institute for Immunology Research, Baylor Research InstitutePolices potentiels d’intérêt TG est consultant pour Astellas Pharma USA et LuminaCare solutions, et a fondé Jacaranda Biomed, Inc Tous les autres auteurs ne signalent aucun conflit potentiel Tous les auteurs ont soumis le formulaire ICMJE pour la divulgation des conflits d’intérêts potentiels Conflits que les éditeurs considèrent pertinents pour le contenu du manuscrit ont été divulgués