Mesurer l’hydrolyse endocannabinoïde: affiner nos outils et notre compréhension

La N-arachidonoyl éthanolamine (AEA, également connue sous le nom d’anandamide) a été la première endogène ligand trouvé interagir avec les récepteurs cannabinoïdes (CB) (1,2). La principale enzyme responsable de sa dégradation est l’amide hydrolase des acides gras (FAAH), une protéine membranaire intégrale qui inactive l’AEA par hydrolyse, produisant de l’acide arachidonique et de l’éthanolamine (3). En 1996, Benjamin Cravatt et ses collègues FAAH purifiés par affinité à partir de foie de rat, ont identifié sa séquence codante et, au cours de la décennie suivante, ont caractérisé sa fonction biologique, ses caractéristiques biochimiques et sa pharmacologie (3). Des progrès significatifs ont été réalisés avec le développement de composés hautement sélectifs qui inhibent FAAH à des concentrations nanomolaires in vivo (comme le carbamate URB597) et par la génération de souris knock-out FAAH, qui entraînent une élévation d’environ dix fois des niveaux endogènes de cerveau AEA (4,5). Ces réalisations ont révélé le rôle fondamental que FAAH joue dans le contrôle de la signalisation AEA in vivo. L’inactivation pharmacologique et génétique de FAAH produit un sous-ensemble de réponses biologiques dépendant de CB1, y compris des effets analgésiques, anxiolytiques, antidépresseurs, stimulant du sommeil et anti-inflammatoires chez les rongeurs, sans les effets secondaires indésirables sur la motilité, la masse corporelle et température corporelle qui accompagne généralement l’agonisme CB1 direct (6). Ainsi, l’inhibition de FAAH constitue un domaine de recherche passionnant et une cible thérapeutique prometteuse. La FAAH est un membre de la famille des enzymes de la serine hydrolase.Cependant, au lieu de la triade catalytique Ser-His-Asp utilisée par la majorité des sérine hydrolases, le site actif de FAAH est composé de la triade catalytique Ser-Ser-Lys caractéristique de la classe d’enzymes amidase-signature ( 6). Des études structurales suggèrent que l’AEA atteint le site actif de FAAH en entrant d’abord dans la membrane puis en se déplaçant à travers le “ la liaison de chaîne acyle ” canal de FAAH, qui est composé de résidus hydrophobes et participe à la reconnaissance du substrat (7,8). Pendant ce temps, une molécule d’eau a également accès au site actif FAAH via un deuxième canal connu sous le nom de port cytoplasmique “ ” Avec Ser241 agissant comme nucléophile, la triade catalytique de FAAH hydrolyse AEA, puis les molécules d’acide arachidonique et d’éthanolamine résultantes sortent par les canaux d’accès à la membrane et d’accès au cytosol, respectivement (6). Le nucléophile Ser241 est la cible de nombreux inhibiteurs pharmacologiques différents de FAAH, y compris URB597. En tant qu’inhibiteur de choix de FAAH pour de nombreuses études, URB597 a démontré une gamme impressionnante d’effets potentiellement thérapeutiques chez les rongeurs, mais il souffre d’une durée d’action relativement courte in vivo (2 – 3   h) (9), et de certaines interactions hors cible avec des enzymes dans les tissus périphériques (10). Une exigence importante pour la découverte de médicaments cliniques est une sélectivité élevée de la cible. L’industrie pharmaceutique a historiquement résisté à la conception d’inhibiteurs d’enzymes irréversibles en tant que candidats médicaments en raison de préoccupations concernant l’augmentation des effets hors cible, ce qui peut entraîner des effets secondaires indésirables. Heureusement, la technologie nouvellement développée permet maintenant aux chercheurs de répondre à cette préoccupation expérimentalement. Ceci est dû en grande partie au développement du profilage protéique basé sur l’activité (ABPP) par le laboratoire Cravatt (11), une technologie qui permet la mesure concomitante de plusieurs activités protéiques, plutôt que de se concentrer sur l’activité d’une enzyme ou simplement quantifier l’abondance des protéines. Cette approche protéomique fonctionnelle utilise le ciblage de site actif de proximité pour cribler des médicaments contre des classes entières d’enzymes dans des échantillons de tissus complexes (12). En effet, la détermination de la sélectivité des inhibiteurs de la sérine hydrolase (y compris ceux qui ciblent les enzymes hydrolysant l’eCB) par des dosages conventionnels basés sur le substrat serait une tâche difficile si l’on considère à la fois l’énorme taille de la superfamille des enzymes sérine hydrolase. humains) et le fait que beaucoup de ces enzymes ne sont pas caractérisées et manquent donc de substrats connus. En tant que tel, ABPP promet d’accélérer considérablement cette importante entreprise. En bref, cette technologie implique deux étapes principales: un dosage initial rapide de l’activité enzymatique totale, suivi d’une analyse plus détaillée d’enzymes spécifiques d’intérêt. Premièrement, des fractions tissulaires partiellement purifiées sont incubées avec une sonde à base de fluorophosphonate marquée avec de la rhodamine, qui se lie de manière covalente au site actif de toutes les sérine hydrolases présentes dans la fraction et les marque par fluorescence. Les enzymes marquées sont ensuite séparées par électrophorèse sur gel et identifiées par leur poids moléculaire, l’intensité de la fluorescence émise reflétant leur abondance relative. Lorsque ce test est effectué sur le même échantillon à la fois en présence et en l’absence d’un inhibiteur, une diminution de l’intensité de la fluorescence en présence d’un inhibiteur indique que cette cible est sensible à l’inhibiteur. La deuxième étape utilise également une sonde à base de fluorophosphonate, mais cette fois marquée avec de la biotine. L’incubation de fractions partiellement purifiées avec cette seconde sonde permet la purification efficace des sérine hydrolases marquées par “ en les tirant ” avec des perles de streptavidine. Cela est suivi par la digestion enzymatique et le séquençage d’enzymes spécifiques par LC-MS-MS, conduisant à leur identification moléculaire et à une quantification approfondie. Une série de rapports récents illustrent clairement la puissance de l’ABPP. Divers inhibiteurs de la FAAH ont été testés pour leur spécificité dans différents tissus, et bien qu’ils soient sélectifs pour la FAAH dans le cerveau, beaucoup d’entre eux possédaient des cibles supplémentaires dans les tissus périphériques tels que le foie et les reins (6). Notamment, l’inhibiteur à base de pipéridine urée PF-750 a démontré une sélectivité remarquable pour FAAH dans de multiples protéomes tissulaires humains et murins, ne montrant aucune activité discernable contre d’autres sérine hydrolases in vitro ou in vivo même à des concentrations relativement élevées (13). Une chose à garder à l’esprit est que les sondes de fluorophosphonate utilisées dans ABPP présentent des propriétés pharmacologiques et biochimiques légèrement différentes sur un site actif de l’enzyme par rapport à un substrat donné, et il est donc important de vérifier les résultats clés avec des méthodes plus conventionnelles. évaluer directement l’hydrolyse du substrat. Néanmoins, l’ABPP constitue une nouvelle technologie puissante qui attend d’être adoptée par de nombreux laboratoires.Les différences pharmacologiques bien connues entre les enzymes orthologues et le fait que les essais pré-cliniques et les données d’efficacité in vivo reposent sur des études sur les rongeurs (et pourraient donc ne pas se traduire automatiquement chez l’homme) constituent un autre obstacle majeur au transfert de nouveaux médicaments du laboratoire au chevet du patient. ). En effet, la plupart des progrès réalisés dans le développement des inhibiteurs de FAAH sont basés sur des données structurales et cinétiques obtenues avec l’orthologue de rat de cette enzyme (rFAAH), et des différences clés sont présentes dans l’orthologue humain (hFAAH) (14). Malheureusement, les efforts pour obtenir des informations structurelles sur la hFAAH ont été entravés par des rendements d’expression faibles dans les systèmes recombinants et des propriétés biochimiques difficiles. Mileni et al. a récemment abordé cette préoccupation en utilisant la mutagenèse dirigée pour créer un “ humanisé ” rat FAAH (h / rFAAH) qui contient le site actif humain dans la protéine mère du rat (14). Cette enzyme mutée présente le profil pharmacologique de hFAAH tout en maintenant les rendements d’expression recombinants élevés et les propriétés biochimiques de la rFAAH. En plus de valider h / rFAAH comme un substitut de dosage utile pour hFAAH, les auteurs ont également résolu sa structure tridimensionnelle à un 2,75 – Å résolution et élucidé la base structurelle pour l’activité accrue (7,6 fois) de PF-750 à hFAAH par rapport à rFAAH. Dans la mesure où la disponibilité de h / rFAAH accélère le processus de développement clinique des inhibiteurs de l’hydrolyse de l’AEA, elle servira d’exemple à la médecine translationnelle plus large. Contrairement aux progrès impressionnants réalisés dans la caractérisation et la manipulation de l’hydrolyse de l’AEA , ce processus s’est déroulé beaucoup plus lentement en ce qui concerne le second eCB bien connu, le 2-arachidonoyl glycerol (2-AG) (15,16). Malgré sa découverte après l’AEA, la 2-AG est apparue comme l’eCB prototypique de plusieurs façons: elle est beaucoup plus abondante et efficace sur les récepteurs CB que l’AEA (17); la machinerie biologique pour la production et l’inactivation de 2-AG est logiquement organisée autour des récepteurs CB (18); et 2-AG s’est avéré être un acteur central dans le phénomène omniprésent de la plasticité synaptique eCB-dépendante (19) et dans la régulation de la neuroinflammation (20). En tant que tel, la manipulation sélective de l’hydrolyse 2-AG in vivo est un objectif excitant avec un potentiel thérapeutique considérable. Plusieurs preuves impliquent la monoacylglycérol lipase (MGL) en tant qu’enzyme principale responsable de l’hydrolyse du 2-AG dans le système nerveux. accumulation de 2-AG dépendante du récepteur dans les neurones corticaux (21); l’immunodéplétion de MGL diminue significativement l’activité d’hydrolyse de 2-AG dans le tissu cérébral de rat (22); et l’ABPP des sérine hydrolases dans le cerveau de la souris a attribué 85% de l’activité totale de l’hydrolyse du 2-AG au MGL (23). MGL est une protéine de 33 kDa qui fonctionne le plus efficacement à un pH proche de 8,0 (24). Il hydrolyse les monoglycérides, mais pas les di- ou triglycérides (24). Il hydrolyse les monoacylglycérols à chaîne moyenne et longue à des taux variables, le plus haut taux d’hydrolyse étant observé pour l’arachidonoylglycérol (que le substrat contienne une liaison 1 (3) ou 2-ester) (25). La MGL n’a pas encore été cristallisée, mais des études de mutagenèse dirigée ont confirmé qu’elle utilise la triade catalytique Ser-His-Asp typique des sites actifs de la plupart des sérines hydrolases (26). MGL est censé contenir un domaine de couvercle mobile couvrant son site actif, qui s’ouvre lorsqu’il interagit avec une interface eau-lipide (26, 27). Cela pourrait être une raison pour laquelle la MGL s’est révélée être une cible difficile pour l’inhibition pharmacologique sélective, puisque les composés hydrophiles ne devraient pas avoir un accès facile au site actif. L’une des approches les plus couramment utilisées pour quantifier l’activité MGL in vitro est la utilisation de substrat radioactif. Le substrat le plus évident pour MGL est le 2-AG, mais la molécule étroitement apparentée 2-oléoylglycérol (2-OG) est également couramment utilisée expérimentalement (probablement en raison de l’efficacité avec laquelle elle est hydrolysée par MGL (21)). Cependant, malgré leur similarité, 2-AG et 2-OG présentent des différences faibles, mais significatives, de leurs cinétiques et affinités pour MGL (communication personnelle), il faut donc faire preuve de prudence lors du remplacement de l’un par l’autre. Un autre point de flexibilité dans le dosage de substrat radiomarqué concerne le fragment qui est marqué. Par exemple, lorsque l’on utilise du 2-AG comme substrat, le groupement arachidonoyle ou le groupement glycérol peuvent être radiomarqués. Dans un essai enzymatique MGL typique, le 2-AG marqué réagit avec l’échantillon contenant l’enzyme pendant une période de temps déterminée, entraînant des taux variables d’hydrolyse en fonction de l’échantillon (et des agents pharmacologiques ajoutés). Cette réaction est ensuite arrêtée par l’addition d’un mélange aqueux / organique, comme dans la procédure d’extraction Folch classique qui est basée sur des rapports volumiques du méthanol et du chloroforme pour séparer les fractions hydrophiles et lipophiles (28).Ainsi, lorsque le 2-AG est hydrolyse, le groupement glycérol hydrophile est libéré et se répartit dans la phase aqueuse, tandis que le groupement acide arachidonique hydrophobe (AA) reste dans la phase organique avec tout 2-AG hydrophobe non hydrolysé. Si le groupement glycérol a été radiomarqué, alors la phase aqueuse peut être récupérée directement et des quantités de 2-AG hydrolysées quantifiées par simple spectroscopie à scintillation liquide (par exemple, voir (29)). D’autre part, si la fraction AA a été marquée, alors la phase organique doit être encore fractionnée par Chromatographie en couche mince pour séparer l’AA libérée du 2-AG non hydrolysé (par exemple, voir (17)). Bien que plus laborieuse, cette dernière approche peut être un contrôle utile pour, par exemple, s’assurer qu’un inhibiteur hydrophobe réduit effectivement l’hydrolyse enzymatique, plutôt que d’interagir directement avec le substrat radiomarqué et d’empêcher sa partition dans la phase hydrophile. Lors de l’étiquetage d’un substrat, il faut faire particulièrement attention à ne pas altérer son intégrité; ainsi, 3H constitue le radiomarqueur de choix. L’absence totale d’une étiquette artificielle est évidemment idéale, et dans ce cas, la mesure de l’AA libérée peut être réalisée par chromatographie en phase gazeuse ou liquide couplée à la spectrométrie de masse. Cependant, ces techniques analytiques directes peuvent parfois être difficiles et longues (30), et manquent souvent de la précision quantitative associée aux techniques radioactives. Un article récent de Muccioli, Labar et Lambert propose une autre approche pour mesurer l’hydrolyse de l’eCB (31). Ces auteurs supposent que l’absence d’inhibiteurs puissants et spécifiques de la MGL pourrait être due en partie à l’inefficacité des tests qui sont couramment utilisés pour caractériser l’activité MGL. Ils ont donc développé un test colorimétrique à faible coût / haut débit pour cribler les composés contre la MGL recombinante humaine purifiée (32). En utilisant ce test, les auteurs identifient un nouvel inhibiteur puissant du MGL, CAY10499, à base de carbamate, qui semble utiliser un nouveau mécanisme d’action (non lié au carbamate) (31). La disponibilité d’une telle méthode efficace pour évaluer les inhibiteurs contre la MGL humaine est un développement bienvenu, et le mécanisme d’inhibition potentiellement unique de CAY10499   mérite certainement plus d’attention. Cependant, bien que cette méthode soit très prometteuse pour évaluer la puissance et la cinétique des médicaments agissant sur la MGL, elle n’aborde pas la sélectivité, et CAY10499 devra donc être testé contre de nombreuses autres sérine hydrolases. Un inconvénient de l’approche colorimétrique est que le substrat chromogène (4-NPA) présente probablement des interactions structurelles et cinétiques différentes avec MGL comparé au 2-AG ou à d’autres substrats, il est donc possible que les inhibiteurs de 4-NPA inhibent L’hydrolyse AG est exactement de la même manière. Ainsi, la série de méthodes que nous avons décrites est complémentaire, et devrait être utilisée en parallèle pour maximiser notre compréhension de l’inhibition MGL: certains pour le criblage de débit, d’autres pour la confirmation. En ce qui concerne le criblage à haut débit, un autre test très similaire basé sur la fluorescence pour le criblage de composés contre la MGL humaine a également été publié l’année dernière (33). Ce test utilise le substrat fluorogénique 7-HCA, et il présente les mêmes avantages et inconvénients décrits ci-dessus. Malgré le MGL cloné il y a plus d’une décennie, des outils importants font encore défaut. Des souris knock-out pour ce gène n’ont pas encore été générées, une structure cristalline de la protéine n’a pas été obtenue, et seulement récemment des composés prometteurs ont été rapportés pour inhiber sélectivement MGL à des concentrations nanomolaires. Un inhibiteur, N-arachidonoyl maleimide (NAM), semble très sélectif pour MGL (23,34), mais son mode d’action — modification covalente des groupes cystéinyl sulfhydryle exposés — est susceptible d’empêcher son utilisation thérapeutique (25) . Il y a eu une absence manifeste de données sur le rôle joué par MGL dans l’hydrolyse du 2-AG in vivo, et de nouveaux outils pharmacologiques aideraient clairement à comprendre l’importance de cette enzyme dans de nombreux processus physiopathologiques modulés par les eCB. Dans ce sens, un rapport récent décrit un inhibiteur MGL puissant et sélectif avec une efficacité in vivo impressionnante (35). En utilisant une combinaison de conception rationnelle et d’ABPP compétitif, le laboratoire Cravatt a développé l’inhibiteur à base de carbamate JZL184. Lors de l’administration à des souris, JZL184 produit un blocage rapide et durable de l’hydrolyse du 2-AG dans le cerveau, entraînant une augmentation de huit fois des taux de 2-AG dans le cerveau sans modifier les taux d’AEA (35). En outre, les souris traitées par JZL 184 présentaient un assortiment d’effets comportementaux dépendant de CB1, y compris l’analgésie, l’hypomotilité et l’hypothermie (35). Ces résultats supportent l’idée que la 2-AG est impliquée de manière centrale dans une large gamme de voies de signalisation dépendant de l’eCB dans tout le système nerveux. Pris conjointement avec des études antérieures, l’image émergente suggère que AEA et 2-AG ont des fonctions distinctes mais qui se chevauchent in vivo.Avec les inhibiteurs sélectifs maintenant disponibles pour deux des principales enzymes d’hydrolyse de l’eCB, FAAH et MGL, les chercheurs sont dans une position privilégiée pour démêler expérimentalement les fonctions spécifiques de l’AEA et du 2-AG dans divers processus biologiques. Un facteur compliquant la manipulation de la signalisation de 2-AG in vivo est l’existence de plusieurs enzymes trouvées pour hydrolyser le 2-AG, dont l’importance relative semble varier entre les types de cellules (36). Par exemple, notre laboratoire a découvert qu’une lignée cellulaire microgliale, BV-2, hydrolyse efficacement le 2-AG en l’absence de MGL, ce qui indique que ces cellules expriment une nouvelle enzyme capable d’hydrolyser le 2-AG (29). Un profil complet des enzymes hydrolysant le 2-AG dans le cerveau de la souris a conduit à l’identification de deux sérine hydrolases non caractérisées, capables d’hydrolyser le 2-AG: ABHD12 et ABHD6 (23). Ces enzymes sont susceptibles de présenter des profils pharmacologiques et cinétiques uniques, ainsi que des profils d’expression et de localisation différents. L’existence de ces enzymes a potentiellement contribué à confondre les résultats obtenus avec la première génération “ MGL ” inhibiteurs, car ces composés pourraient ne pas différencier MGL, ABHD12 et ABHD6. Fait intéressant, une étude récente visant à évaluer la sélectivité des médicaments couramment utilisés pour inhiber la biosynthèse du 2-AG a identifié la tétrahydrolipstatine (THL) comme un inhibiteur relativement puissant de l’ABHD12 (37). En outre, ABPP a été utilisé pour développer de nouveaux inhibiteurs pour de nombreuses enzymes, y compris ABHD6 (38). Ces nouveaux médicaments sont susceptibles de jouer un rôle essentiel dans la clarification du réseau de signalisation complexe 2-AG. En effet, certaines des fonctions précédemment attribuées à MGL pourraient en fait être médiées par ABHD12 ou ABHD6, il sera donc intéressant de voir l’importance de ces enzymes. Malgré leurs similitudes biochimiques, il existe des différences importantes entre les rôles physiopathologiques de l’AEA. et 2-AG, et il sera utile d’avoir les outils pour les manipuler indépendamment in vivo pour maximiser le potentiel thérapeutique de ciblage de la signalisation eCB. De nombreuses nouvelles techniques ont été développées pour aider à atteindre cet objectif. L’ABPP est sans doute l’ajout le plus significatif à l’arsenal des tests d’activité enzymatique actuellement utilisés pour étudier de nouveaux médicaments potentiels. Cette technique fournit un niveau sans précédent d’évaluation complète impartiale, car elle peut interroger simultanément la fonctionnalité de chaque membre de classes entières d’enzymes dans des échantillons de tissus natifs. Cependant, le développement initial d’inhibiteurs de qualité reste un pré-requis, et bien que l’ABPP puisse apporter une contribution significative à cette entreprise, d’autres tests (nouveaux et anciens) peuvent fournir des solutions vitales là où l’ABPP ne répond pas. Par exemple, de nouveaux dosages colorimétriques permettent le criblage à haut débit d’un grand nombre d’inhibiteurs potentiels de MGL. Cela devrait s’avérer être un premier crible précieux pour identifier de nouveaux composés de plomb, qui peuvent ensuite être explorés et étendus avec d’autres méthodes, telles que le comptage par scintillation de 2-AG radiomarqué ou spectrométrie de masse pour évaluer directement les niveaux de 2-AG corticothérapie. peut aider à étoffer les détails de l’utilité ultime d’un inhibiteur. C’est une période passionnante pour la recherche sur la signalisation eCB. Les récepteurs CB sont abondamment exprimés dans tout le système nerveux (et les tissus périphériques) où ils induisent une multitude d’effets thérapeutiques. Plutôt que de cibler ces récepteurs directement avec des agonistes exogènes, des efforts sont en cours pour activer ces récepteurs indirectement en augmentant les niveaux de leurs agonistes endogènes via l’inhibition de l’hydrolyse de l’eCB. En plus d’utiliser des ligands naturels, avec l’avantage de leurs adaptations évolutives durement acquises, cette approche a l’avantage supplémentaire que l’activation accrue des récepteurs CB ne se produit que dans le sous-ensemble des récepteurs où les ECB sont produits de manière endogène (ceci est particulièrement important). du fait que les récepteurs CB sont parmi les récepteurs les plus abondants dans le cerveau et sont donc sensibles à divers effets secondaires lorsque des agonistes directs sont administrés par voie systémique). Avec AEA hydrolyse in vivo médiée par une seule enzyme bien caractérisée (FAAH), le développement d’inhibiteurs de l’hydrolyse AEA a progressé en douceur au point où les inhibiteurs spécifiques et puissants avec une bonne efficacité à la FAAH humaine atteignent des essais cliniques. MGL, ABHD12 et ABHD6 sont clairement sur la même trajectoire. En résumé, des progrès significatifs ont été réalisés avec des techniques innovantes capables de mesurer l’activité des enzymes d’hydrolyse eCB, et le développement de nouveaux inhibiteurs pharmacologiques contribue à améliorer notre compréhension de la les subtilités de ce système de signalisation fascinant.L’image émergente semble être qu’il existe un certain degré de redondance avec la signalisation eCB in vivo (à la fois entre la fonctionnalité des deux principaux eCB et en ce qui concerne l’hydrolyse 2-AG), mais chaque nouveau joueur dans ce système apporte également de nouvelles propriétés et des possibilités à l’ensemble. Nous sommes tous désireux de compléter le puzzle.