Pneumocystis jiroveci Génotypes dans la population espagnole

Cette étude décrit la distribution génotypique de Pneumocystis jiroveci dans des échantillons respiratoires prélevés chez des patients atteints du syndrome d’immunodéficience acquise SIDA avec pneumonie P jiroveci et sujets immunodéficients immunodéprimés avec différentes maladies pulmonaires chroniques. Le génotypage a été basé sur l’analyse de locus génétiques indépendants: le grand mitochondrial ARN ribosomique sous-unitaire mt LSU fragment d’ARNr évalué par séquençage direct et gène de la dihydroptéroate synthase DHPS; L’analyse de l’ARNr mt LSU a révélé la présence de polymorphismes différents pour les deux populations. Le génotype majeur, C / C, s’est avéré significativement plus élevé chez les patients atteints de SIDA et de pneumonie à P. pneumonia que chez les patients atteints de maladie pulmonaire. taux de génotypes A / C et T / C était similaire dans les deux groupes L’analyse des génotypes DHPS évalue la prévalence de ses génotypes possibles, avec% de génotypes liés à la résistance aux sulfamides Les données suggèrent une source commune d’infection entre les deux groupes

Pneumocystis jiroveci anciennement connu sous le nom de Pneumocystis carinii forma specialis hominis reste l’agent pathogène opportuniste le plus fréquent chez les personnes infectées par le VIH L’incidence de Pjiroveci pneumoniae PcP a diminué chez les patients atteints du SIDA dans les pays développés avec une chimioprophylaxie spécifique. , avec l’administration de HAART Malgré cela, la PcP est toujours une cause importante de morbidité et de mortalité dans le monde Aujourd’hui, l’intérêt pour l’infection à P. jiroveci ne se limite pas aux patients atteints du SIDA; il représente également une infection opportuniste commune et grave chez d’autres groupes immunodéprimés, tels que les receveurs de transplantation d’organes , les patients atteints de maladies auto-immunes recevant un traitement immunosuppresseur et les patients atteints de néoplasies . patients atteints de maladies pulmonaires chroniques Cependant, il n’a pas encore été établi si ces personnes, qui sont des producteurs d’expectorations, pourraient représenter une source d’infection pour les personnes immunodéprimées sensibles. En l’absence d’une méthode fiable de culture P jiroveci, biologie fondamentale et épidémiologie de ce champignon restent mal compris Récemment, des gènes importants ont été identifiés pour l’analyse et la caractérisation de P jiroveci L’étude de différents gènes loci-mitochondrial grande sous-unité ARN ribosomique ARN mt LSU, qui est impliqué dans les fonctions métaboliques de base, et le gène pour la dihydroptéroate synthétase DHPS, une cible de sulfone et de sulfo En outre, les variations du gène DHPS suggèrent que l’utilisation répandue du triméthoprime-sulfaméthoxazole et de la dapsone exerce une pression sélective sur les génotypes P jiroveci circulant chez les humains , il est potentiellement utile comme marqueur pour les changements dans les niveaux de sensibilité, ainsi que pour la caractérisation et le typage de P jiroveci Bien que différentes études de génotype chez les patients atteints du SIDA et PcP ont été rapportées aux États-Unis et en Europe centrale et du Nord. , on dispose de peu d ‘informations sur la distribution des génotypes de P jiroveci dans le sud de l’ Europe Le schéma de variation génétique de P jiroveci isolé des patients non immunocompromis par ce pathogène est encore peu connu et n’a été étudié que chez les enfants. Cette étude visait à évaluer l’épidémiologie génétique de P jiroveci par l’analyse de loci indépendants avec le SIDA et la PcP, et chez des sujets atteints de différentes maladies pulmonaires chroniques

Matériaux et méthodes

Les sujets inclus dans cette étude prospective étaient les premiers patients consécutifs avec une maladie pulmonaire chronique et les patients atteints du SIDA qui étaient soupçonnés d’avoir PcP entre Janvier et Septembre dans le département de médecine interne de l’hôpital universitaire Virgen del Rocio Séville, Espagne Un total de patients Chez les patients restants, seuls des échantillons d’expectoration ont été obtenus. Chaque patient a subi un examen clinique et biologique, qui a été réalisé avec un questionnaire standardisé et des échantillons de BAL ou d’expectorations. ont été obtenus pour l’analyse Lorsque les deux échantillons étaient disponibles, seuls les échantillons de BAL ont été analysés. Les données supplémentaires sur les patients sont présentées dans le tableau

Caractéristiques de patients inclus dans l’étudeDurant la période d’étude, P jiroveci a été détecté chez% des sujets atteints de maladies pulmonaires chroniques aucun d’entre eux avec PcP et% de patients infectés par le VIH soupçonnés L’étude a été approuvée par le comité d’éthique de notre hôpital. La détection de PJiroveci BAL et / ou des échantillons d’expectoration ont été obtenus chez les patients. Après digestion avec la protéinase K à ° C, l’ADN de P jiroveci a été extrait avec un kit commercial de Qiagen Deux loci indépendants du génome de P jiroveci ont été amplifiés: mt LSU rRNA et le protocole DHPS A -step a été utilisé pour l’amplification du fragment mt LSU rRNA par PCR nichée, comme décrit ailleurs En bref, dans le premier tour d’amplification, les amorces externes pAZ-E ‘-GAT GGC TGT TTC CAA GCC CA-‘ et pAZ-H ‘-GTG TAC GTT GCA AAG TAC TC-‘ ont été utilisés Ceci a donné un fragment -bp Le second cycle d’amplification a utilisé les amorces pAZ-X ‘-GTG AAA TAC AAA TCG GAC TAG G-‘ et pAZ-Y ‘-TCA CTT AAT ATT AAT TGG GGA GC-‘ et a donné un -bp produit Les deux cycles d’amplification ont subi des cycles Le gène à copie unique de DHPS a été amplifié par les amorces DHPS- ‘-GCG CCT ACA CAT ATT ATG GCC ATT TTA AAT C-‘ et DHPS- ‘-GGA ACT TTC AAC TTG GCA ACC AC – ‘dans tous les échantillons positifs par PCR nichée Le mélange PCR a été préparé à un volume final de μL, contenant μL de matrice d’ADN, solution tampon PCR, U Taq polymérase Bioline, mmol / L de mélange nucléotide triphosphate, pmol de chaque amorce , et mmol / L MgCl Un protocole Touchdown-PCR a été utilisé pour amplifier les échantillons, donnant un fragment -bp Après une étape de démarrage à chaud à ° C pendant min, une procédure de Touchdown a été dosée avec une étape de dénaturation à étape suivie: la température a été diminuée de ° C par cycle de ° C à ° C pendant les premiers cycles Une étape d’extension suivie à ° C pour s Dans les cycles de cycles suivants à, les étapes ont été ° C pour s, ° C pour s, et ° C pour s Ceci a été suivi par une étape d’extension finale à ° C pour les produits d’amplification. analysé par électrophorèse sur un gel d’agarose% contenant du bromure d’éthidium, et les bandes ont été visualisées avec de la lumière UV Pour éviter les résultats faussement positifs dus à la contamination, des pipettes avec filtres ont été utilisées à tous les stades extraction d’ADN, préparation du mélange réactionnel, Pour détecter toute contamination croisée, toutes les procédures de PCR ont été réalisées avec un contrôle négatif de l’eau stérile. Caractérisation du gène de P. jiroveci Les produits PCR de PCR nichée ont été purifiés avec des colonnes Sephacryl S- Amersham Pharmacia Biotech et réamplifiées avec ABI Prism dRhodamine Terminator Cycle Ready Kit de réaction Ready PE Biosystèmes appliqués Puis, pour chaque réaction, μL de produit de PCR, μL de terminaison prêt réactio Les produits d’extension ont été purifiés par une procédure de précipitation à l’éthanol pour éliminer les terminateurs de colorant en excès. Chaque culot d’échantillon a été remis en suspension dans un ul de réactif de suppression de matrice et chauffé à 0 ° C pendant une dénaturation de l’électrophorèse. sur le séquenceur ABI Prism PE Applied Biosystems conformément aux recommandations du fabricant Les fragments d’ADN séquencés ont été analysés par Sequence Navigator, version PE Applied BiosystemsRestriction analyse enzymatique Le μL du polymorphisme de longueur de fragment de restriction PCR RFLP a été divisé en aliquotes Un a été utilisé pour confirmer la présence d’un fragment -bp du gène DHPS Les deuxième et troisième parties aliquotes ont été utilisées pour identifier la présence de type sauvage par rapport aux mutations dans les codons et par RFLP avec AccI et HaeIII Roche Diagnostics, respectivement Lorsque la mutation est présente, un -bp De même, après RFLP, des bandes apparaissent à et avec AccI, et bp et bp avec HaeIII dans des échantillons de type apparaissent Analyse statistique Le test χ ou le test exact de Fisher a été utilisé pour évaluer les différences entre les proportions. Les résultats ont été considérés comme statistiquement significatifs à P & lt; Les analyses statistiques ont été réalisées par la version SPSS et le programme statistique EpiInfo, version Centers for Disease Control and Prevention

Résultats

Amplification avec des amorces spécifiques Les amorces mt LSU rRNA ont amplifié un fragment -bp en% des échantillons provenant de cas de maladies pulmonaires et de cas de PcP chez des patients séropositifs. L’amorce DHPS a amplifié une bande -bp en% des échantillons positifs obtenus chez des patients atteints de maladie pulmonaire. et tous les fragments amplifiés ont été examinés pour des polymorphismes génétiques par séquençage direct de l’ARNr de LS mt ou RFLP des gènes DHPS Fréquence du génotype Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau Des types décrits pour le locus de l’ARNr mt LSU. , les génotypes ont été isolés dans l’étude actuelle Les génotypes ont été distingués sur la base des polymorphismes à nt et le génotype était le pourcentage le plus commun; génotype% était moins commun Le génotype% était le deuxième génotype le plus commun dans notre région Comme le montre le tableau, en% des échantillons analysés, la co-infection avec plusieurs souches de P jiroveci pouvait être détectée chez ces sujets, le génotype C / T était isolé

Tableau View largeTélécharger slidePneumocystis jiroveci génotypes trouvés chez les patients espagnolsTable View largeTélécharger slidePneumocystis jiroveci génotypes trouvés chez les patients espagnolsDHPS tableau d’analyse génétique a révélé le génotype le plus fréquent parmi les cas analysés; il représentait% des échantillons de génotypes et se produisait% et% du temps, respectivement; et le génotype était rare, se produisant seulement% du temps En% des échantillons amplifiés avec les ensembles d’amorces DHPS, nous avons trouvé un mélange de génotypes, ce qui démontre la possibilité de co-infection chez les sujets analysés. ARNr et DHPS ont révélé que seuls les génotypes ont été trouvés à partir des combinaisons possibles: /%, /%, /%, /%, /%, /%, /% et mixtes / mixtes% Les génotypes multilocus les plus courants La figure montre le taux de génotypes de la région mR LSU rRNA et le gène DHPS chez les sujets atteints de maladies pulmonaires par rapport aux patients atteints du SIDA et de la PcP. Dans les deux groupes de patients, le génotype% et% était le plus fréquent, mais sa présence était significativement plus élevée chez les patients atteints de SIDA et de PcP. ymorphisme avec les fréquences les plus basses% et% Le génotype était le plus fréquent chez les sujets atteints d’une maladie pulmonaire par rapport aux patients atteints du SIDA et de la PcP, mais ce résultat n’était pas statistiquement significatif% vs%; P =, probablement en raison du faible nombre de cas Enfin, un mélange de génotypes n’a été détecté que dans le groupe des maladies pulmonaires%

Figure Vue largeDownload slideGenotype fréquence chez les patients atteints de maladies pulmonaires CPD contre les patients atteints de sida et Pneumocystis jiroveci pneumonie PcP à la grande sous-unité mitochondriale ARN ribosomique mt LSU rRNA et loci DHPS Génotype représente polymorphisme C / C à mt LSU rRNA et Trh / Pro au gène DHPS Le génotype représente le polymorphisme A / C et le génotype Ala / Pro représente le polymorphisme à T / C et le génotype Thr / Ser n’est présent que dans le gène DHPS Ala / Ser « Mixed » indique la présence de & gt; Génotype représente le polymorphisme C / C à mt LSU rRNA et Trh / Pro sur le gène DHPS Génotype représente le polymorphisme C / C à mt LSU rRNA et Trh / Pro Le génotype représente le polymorphisme A / C et le génotype Ala / Pro représente le polymorphisme à T / C et le génotype Thr / Ser n’est présent que dans le gène DHPS Ala / Ser « Mixed » indique la présence de & gt; L’analyse du locus DHPS dans les deux groupes a révélé une fréquence de type sauvage Thr / Pro de% chez les patients atteints de maladies pulmonaires chroniques versus% chez les patients atteints de SIDA et PcP P = Le taux de mutation des génotypes dans le codon et de mutation dans les groupes était similaire : des changements de codon ont été retrouvés chez% des patients atteints de maladies pulmonaires chroniques et chez% des patients atteints de SIDA et PcP, et les changements de codons ont été retrouvés en% chez les patients atteints de maladies pulmonaires chroniques et chez% des patients atteints de SIDA et PcP Des mutations génotypiques dans les codons / dans le gène DHPS ont été trouvées dans la PcP associée au SIDA. La fréquence des génotypes mixtes était similaire chez les patients atteints de maladies pulmonaires et chez les patients atteints du SIDA et de la PcP.

Discussion

Cependant, une étude épidémiologique récente impliquant des patients atteints du SIDA aux États-Unis, qui a analysé les génotypes de l’ARNr de LSU, a révélé une fréquence élevée de génotype% et de génotype% Comparaison de cette étude et de la Les données obtenues dans notre population montrent une inversion claire entre les génotypes et les données montrent également une différence significative significative dans le génotype mt LSU rRNA entre les groupes inclus dans l’étude: les patients atteints de maladie pulmonaire chronique avaient un taux élevé de génotype, presque similaire à Par contre, les patients atteints de PcP associée au SIDA avaient un taux de génotype plus élevé L’analyse des mutations décrites dans le gène DHPS ne révèle pas de différences significatives entre les deux groupes, mais le type sauvage était le plus fréquent dans les maladies pulmonaires chroniques. aux patients atteints du SIDA% Génotype Ala / Ser était seulement présent chez les patients atteints du SIDA Notre étude a trouvé un rat inférieur e des mutations DHPS% chez les patients atteints de maladies pulmonaires chroniques et% chez les patients atteints du SIDA que le% trouvé dans une étude de patients atteints de PcP associée au sida aux États-Unis , mais nous avons trouvé un taux similaire aux études antérieures réalisées en Europe Dans notre étude, le nombre de patients identifiés comme ayant le gène DHPS semble être inférieur Seulement en% de sujets atteints de maladies pulmonaires chroniques et en% de patients atteints de SIDA et PcP étions capables de détecter les génotypes DHPS. taux d’amplification obtenu chez les patients atteints de maladie pulmonaire chronique est peut-être lié à une charge pathogène plus faible dans les échantillons, mais c’est la première fois que DHPS a été génotypé chez ce type de patient. Le taux d’amplification pour les patients atteints du SIDA est similaire à études publiées, dans lesquelles les taux d’amplification ont été trouvés à ~% -% [,,] Notre étude s’est concentrée sur l’établissement de la distribution du génotype de P jiroveci dans notre population Pour cette raison, nous avons sélectionné mt LSU ARNr car il a un haut degré de conservation génétique, et parce qu’il est utile de détecter les différences intraspécifiques entre les populations Le gène DHPS, qui est lié à la résistance aux sulfamides, a été sélectionné comme marqueur du taux de mutation, ce qui nous permettrait de La comparaison des données obtenues chez des patients atteints de maladies pulmonaires chroniques et chez des patients atteints du SIDA révèle un profil similaire de génotypes dans l’analyse de la région de l’ARNr de LS mt dans des échantillons isolés de la même ville, apportant un soutien à la notion de source infectieuse commune Ces résultats sont en accord avec des études de pays européens qui suggèrent une transmission de personne à personne [,,] Un modèle animal expérimental a montré que les organismes Pneumocystis sont capables de répliquer dans l’alvéole pulmonaire de l’hôte immunocompétent, gardant ainsi leur pouvoir infectieux intact, ce qui suggère que Les patients atteints de maladies pulmonaires chroniques qui sont colonisés par ce pathogène pourraient être des réservoirs et une source d’infection dans les populations humaines Le développement de mutations DHPS a été associé à une prophylaxie antérieure aux sulfamides ou sulfones En Espagne, l’utilisation du triméthoprime-sulfaméthoxazole est chimioprophylaxie standard contre la PcP chez les patients atteints du SIDA; Cependant, les sulfamides sont rarement utilisés pour traiter les maladies pulmonaires infectieuses. Ils sont souvent traités avec des quinolones. Les résultats obtenus par RFLP montrent une plus grande présence de mutations chez les patients atteints du SIDA que chez les patients atteints de maladies pulmonaires chroniques. une source commune d’infection et de transmission du P jiroveci muté de patients atteints du SIDA à des patients atteints de maladies pulmonaires chroniques. Les résultats actuels montrent la présence de variations génétiques seulement parmi les combinaisons des génotypes possibles détectés à chaque locus individuel. En outre, par typage multilocus, /, /, et / types étaient les plus souvent trouvés, avec un taux de% L’analyse des données obtenues par typage multilocus révèle un taux de co-infection%, qui est dans le%% taux rapporté par d’autres groupes qui ont utilisé la même approche , mais inférieur au taux de% trouvé avec l’analyse du polymorphisme de conformation simple brin En résumé, pour la première fois, les génotypes P jiroveci sont d Nous avons trouvé une forte présence du génotype C / C et une inversion claire entre les génotypes A / C et T / C, suggérant une variation géographique; et nous avons trouvé un taux élevé de mutations dans le gène DHPS Le même schéma génotypique dans les isolats de patients atteints de SIDA et de PcP et chez les sujets atteints de maladies pulmonaires chroniques dans la même zone géographique suggère une source infectieuse commune possible Ceci représente une étape vers la compréhension de l’épidémiologie d’infection à P. jiroveci, et des recherches plus poussées pour établir une relation entre le génotype et la virulence seront nécessaires

Remerciements

Nous remercions Virginia Nieto pour son aide dans la préparation de l’article en manuscrit. Soutien financier Cinquième programmeur-cadre du contrat de la Commission européenne QLK– et ministère de la Science et Technologie espagnol numéro de référence SAF-Conflit d’intérêt Tous les auteurs: Pas de conflit